Il dipinto proviene dalla chiesa di San Francesco al Prato a Perugia, nella quale era già stato spostato varie volte a seguito delle disposizioni tridentine; durante questi trasferimenti interni, a seguito di un incidente ignoto l’opera subisce un danno nella figura di San Sebastiano e forse per questo motivo non viene scelta dalle truppe napoleoniche per la requisizione. In origine l’opera appartiene alla famiglia Martinelli, che incarica Perugino ma con cui egli ha delle controversie, documentate nel 1520 quando il pittore cita in giudizio alcuni membri per il mancato pagamento: la cifra pattuita era di 90 fiorini, secondo le volontà del capostipite Martinello morto nel 1504 probabilmente per l’epidemia di peste scatenatasi a Perugia, tuttavia il dipinto viene terminato in grande ritardo, solo nel 1518, come si legge nell’iscrizione riportata sulla cornice del plinto. La composizione richiama il coevo Martirio di San Sebastiano in una chiesa non distante da Città della Pieve, San Sebastiano a Panicale.